Dados do Trabalho

Título

PADRONIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO DE DNA DE BAÇO A SEREM USADAS COMO PROTOCOLO PARA DETECÇÃO DE PARASITAS DA MALÁRIA HUMANA POR qPCR.

Introdução

O diagnóstico laboratorial sensível da malária humana ainda é um desafio, pois o método padrão ouro é a gota espessa com coloração pelo giemsa, porém apresenta limitações dificultando o controle da malária. O baço retém uma proporção de eritrócitos infectados com trofozoítos e esquizontes, porém a maioria das formas maduras citoaderem em outros órgãos, o que impede a filtração pelo baço.

Objetivo(s)

Padronizar um método de extração de DNA de baço a serem usadas como protocolo para detecção de parasitas da malária humana por qPCR e pesquisar a presença de Plasmodium sp. em baços de pacientes vítimas de trauma, Manaus, Amazonas

Material e Métodos

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Humanos da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (CEP/FMT-HVD-AM) (CAAE) 31739220.4.0000.0005. Inicialmente, realizou-se a microtomia de um baço parafinado proveniente de um paciente controle positivo diagnosticado por microscopia em gota espessa anteriormente. Foi desparafinizado com xilol e etanol. Então, foi realizado a extração de DNA com dois kits de extração comercial diferentes com adaptações na metodologia. Foi realizada a qPCR com o sistema Taqman para detectar gênero especifico para Plasmodium sp. e espécie especifico com o foco em regiões conservada do gene PvmtCOX1. Por fim foram analisadas 200 amostras de baço de pacientes vítimas de trauma submetidos a esplenectomia em Manaus, Amazonas que foram selecionadas do período de 2015 a 2019 de um laboratório referência para o (SUS).

Resultados e Conclusão

Padronizou-se com sucesso o método de desparafinização e extração de DNA de Plasmodium vivax. A amostra de DNA extraída a partir desse protocolo apresentou-se positiva na qPCR para gênero especifico e espécie especifico de P.vivax com o número de cópias 106.063,016. Das 200 amostras analisadas como teste todas apresentaram-se negativa na qPCR. A fixação de tecidos em parafina é um método prático e eficiente para sua preservação. Contudo esse tipo de fixação resulta no enovelamento de proteínas nucleares, na formação de ligações entre proteínas e DNA e na fragmentação do DNA, o que dificulta a extração dessa classe de moléculas de tecidos fixados. A concordância entre PCR em Tempo Real e tecidos foi boa para identificação de Plasmodium vivax. Futuros estudos podem utilizar essa abordagem metodológica contribuindo com o conhecimento sobre as técnicas de biologia molecular aplicada no diagnóstico de malária.

Palavras-chave

Esplênica. Malária. Plasmodium vivax. Diagnóstico. Extracao DNA. PCR.