Dados do Trabalho

Título

PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE RT-PCR CONVENCIONAL PARA DETECÇÃO DO VÍRUS DA CINOMOSE CANINA

Introdução

A cinomose canina é uma doença infectocontagiosa que acomete cães domésticos, podendo ser fatal para esses animais. Pode, também, causar doença em outras espécies de mamíferos selvagens, sendo causada pelo Vírus da Cinomose Canina (CDV), espécie Canine morbillivirus, gênero Morbillivirus, família Paramyxoviridae.

Objetivo(s)

Descrever a padronização da técnica de RT-PCR convencional para a detecção parcial do genoma do Vírus da Cinomose Canina.

Material e Métodos

Foram confeccionados, a partir de análise bioinformática, um controle positivo sintético (g-Block) e dois oligonucleotídeos (CINO-F e CINO-R) (SIGMA-ALDRICH). Para a padronização da técnica, foi realizado um gradiente de temperatura para avaliar a temperatura de anelamento (Tm) ideal para os primers, tendo sido realizado, após isso, a validação e desempenho do método a partir de amostras clinicamente positivas para o CDV. Foi realizado um limite de detecção (LD) dos primers, onde as amostras foram triadas pelo protocolo de RT-PCR em uma etapa, utilizando, para isso, um kit comercial (INVITROGEN). Uma amostra de sangue, urina e uma de fezes foram processadas a partir do ácido nucleico puro e diluído. O desempenho do método foi realizado em triplicatas por dois manipuladores, e o resultado de presença e ausência de amplificação foi anotado para posterior análise estatística, a partir dos parâmetros de Sensibilidade, Reprodutibilidade, Especificidade, Acurácia e Índice de Kappa.

Resultados e Conclusão

Para a padronização da técnica de RT-PCR convencional, dentre as temperaturas de anelamento testadas, a que se mostrou mais eficiente foi a de 69°C, observando-se bandas bem evidentes e específicas. Em relação ao LD, a amplificação foi visualizada apenas nas amostras clínicas puras. Já para o controle positivo (g-Block) foi observada amplificação nas amostras puras e diluídas até cinco vezes. Ainda sobre o desempenho do método, o resultado das análises estatísticas determinou uma força de coincidência considerada moderada, segundo o Índice de Kappa de Cohen, Sensibilidade de 48,28%, Reprodutibilidade mínima de 80% e máxima de 93,33%, Reprodutibilidade de 86,67%, Especificidade de 100% e Acurácia de 96,67%. Com base nos resultados obtidos, podemos concluir que estes foram satisfatórios com relação à padronização da RT-PCR convencional utilizando os primers e g-Block desenhados neste estudo, podendo este ensaio ser aplicado no diagnóstico molecular da rotina clínica veterinária.

Palavras-chave

Cinonomose canina. Vírus da cinomose canina. PCR convencional.