Dados do Trabalho

Título

Desenvolvimento e avaliação do kit diagnóstico SmITS-LAMP liofilizado para o diagnóstico molecular da esquistossomose

Introdução

A esquistossomose mansônica é uma doença tropical negligenciada causada pelo helminto Schistosoma mansoni. O diagnóstico padrão ouro é o Kato-Katz, o qual apresenta uma baixa sensibilidade para detectar pessoas infectadas com baixa carga parasitária. Nesse caso, uma alternativa ao método parasitológico são os testes moleculares que conseguem identificar a população infectada com baixa carga, visto que esses testes atuam por meio da amplificação do DNA do parasito na amostra. O LAMP é um teste molecular sensível, específico e rápido, pois trabalha em condições isotérmicas, o que possibilita sua adaptação à forma de kit diagnóstico e facilita seu uso em diversas condições, inclusive em campo. No formato de kit diagnóstico, os reagentes podem ser liofilizados, o que também minimiza sua manipulação e possíveis contaminações.

Objetivo(s)

Otimizar o sistema SmITS-LAMP com reagentes liofilizados para avaliar seu uso como kit diagnóstico.

Material e Métodos

O sistema SmITS-LAMP não liofilizado foi inicialmente avaliado por meio de uma curva de sensibilidade analítica para identificação da concentração mínima de DNA detectada.Em seguinda foram preparados dois Master Mix para a liofilização. O Sistema 1 foi preparado com todos os reagentes: ThermoPol buffer (1x), MgSO4 (6 mM), dNTPs (1,8 mM), primers F3, B3 e Loop (0,4 pmol), primers FIP e BIP (1,6 pmol), Betaína (0,2 M) e DNA polimerase Bst 2.0 WarmStart ® (8000 U/mL). Já o sistema 2 foi preparado sem Betaína e enzima Bst 2.0 WarmStart, as quais só foram adicionadas no momento do experimento do LAMP. Ambos os sistemas foram liofilizados no liofilizador Labconco (Triad, Kansas, Missouri, EUA) e, posteriormente avaliados por meio de uma curva de sensibilidade analítica. Este estudo foi financiando pelo CNPq/ PROEP 400755/2019-0.

Resultados e Conclusão

O resultado inicial da sensibilidade do SmITS-LAMP foi de 10 fg e seguiu para a etapa de liofilização. Na avaliação dos sistemas liofilizados, apenas o sistema 1 apresentou amplificação, com uma sensibilidade de 1 ng, o qual foi reprodutível quando o teste foi realizado em duplicata. Com isso, conclui-se que a diminuição da sensibilidade ocorreu devido à liofilização, sendo necessárias novas etapas de otimização do SmITS-LAMP para alcançar igual desempenho comparável ao sistema não liofilizado.

Palavras-chave

SmITS-LAMP, Liofilização, Kit diagnóstico, Schistosoma mansoni.