Dados do Trabalho

Título

Desenvolvimento de PCR em tempo real multiplex para detecção de genes de resistência a claritromicina para o grupo Mycobacterium abscessus

Introdução

A identificação molecular de M. abscessus e seu perfil de resistência aos fármacos são importantes na escolha da terapêutica correta. No entanto, são necessários vários testes para que essas informações sejam fornecidas ao clínico.

Objetivo(s)

O presente trabalho desenvolveu uma PCR em tempo real multiplex (mqPCR) para detecção de genes de resistência induzida e adquirida a claritromicina (CLA).

Material e Métodos

Foram utilizados isolados de origem pulmonar e extrapulmonar, encaminhados ao Instituto Adolfo Lutz (IAL) no período de janeiro de 2010 a dezembro de 2012, identificados pela técnica PRA-hsp65 como M. abscessus tipo 1 (n=135, 65,5%) e tipo 2 (n=71, 34,5%). Os isolados foram submetidos ao teste fenotípico de concentração inibitória mínima (CIM) para CLA com leitura nos dias três e 14. O sequenciamento de Sanger dos genes hsp65 e rpoB foi realizado para identificação de subespécies e dos genes erm(41) e rrl para detecção de mutações, estudo de alvos, desenho de iniciadores e sondas e comparação dos resultados com a mqPCR elaborada. A PCR convencional foi realizada para verificar presença de deleção no gene erm(41). A mqPCR foi desenvolvida empregando-se sondas TaqMan®

Resultados e Conclusão

Foram desenhados iniciadores e sondas para cinco detecções: gene erm(41) com comprimento total (WT) e com deleção; gene erm(41) T28 (WT) e C28; gene rrl A2058 (WT). Na padronização da mqPCR foram determinadas as concentrações ótimas dos iniciadores e sondas, a especificidade química e o limite mínimo de detecção (LMD) com os respectivos Cts estabelecidos para cada alvo. O LMD-IC95% foi avaliado para aplicação diagnóstica do teste. Entre os isolados testados na mqPCR, 191/206 (92,7%) foram concordantes com todos os métodos, moleculares e fenotípico, e 13/206 (6,3%) foram concordantes apenas entre os métodos moleculares. Dois isolados (1,0%) foram discordantes na mqPCR em relação ao sequenciamento do gene rrl. Os 13 isolados discordantes entre a mqPCR e o CIM também mostraram discordância no teste padrão-ouro. A mqPCR obteve 204/206 (99,0%) isolados concordantes em relação ao sequenciamento de Sanger, apresentando sensibilidade e especificidade de 98% e 100%, respectivamente, considerando o método padrão-ouro, e 92% e 93% em relação ao CIM. O mqPCR mostrou-se uma ferramenta de fácil aplicação, minimizando a possibilidade de contaminação, erros e tempo de liberação.

Palavras-chave

Reação em Cadeia da Polimerase Multiplex; Mycobacterium abscessus; claritromicina; resistência microbiana a medicamentos; Testes de Sensibilidade Microbiana.