Dados do Trabalho

Título

Caracterização da α-fucosidase de Rhodnius prolixus e sua interação com Trypanosoma cruzi

Introdução

A doença de Chagas é uma doença tropical negligenciada causada pelo protozoário Trypanossoma cruzi. Uma das formas de transmissão do parasito é através de fezes e urinas contaminadas de triatomíneos. Rhodnius prolixus é um importante modelo de estudo e um dos principais transmissores da doença de Chagas. Dentre as diferentes enzimas intestinais de R. prolixus, podemos destacar a α-fucosidase (EC 3.2.1.51) que é uma glicosídeo hidrolase da família 29 (GH29) responsável pela hidrólise de ligações glicosídicas em fucosídeos e glicoconjugados. Além disso, como parte do ciclo do parasito ocorre no tubo digestório do inseto, e T. cruzi possui uma extensa rede de glicoconjugados de membrana, essa enzima pode estar envolvida na interação parasito-vetor.

Objetivo(s)

Caracterizar α-fucosidase em Rhodnius prolixus e verificar sua interação com Trypanosoma cruzi.

Material e Métodos

RNAi: Para inibição da expressão gênica injetamos dsRNAs para α-fucosidase e GFP (Green Fluorescent Protein) como controle exógeno. O silenciamento foi verificado por qPCR.
ENSAIOS ENZIMÁTICOS: Substrato 4-metilumbeliferil α-L-fucopiranosídeo (No M8527). Fluorescência medida no comprimentos de onda λEx = 355 nm e λEm = 460 nm, a 30◦C por 60 min com leitura cada minuto. A quantidade de proteína foi determinada com Coomassie Blue G.
ADESÃO: O intestino médio posterior cortado longitudinalmente foi lavado em PBS e incubado com T. cruzi x10^5 em agitador vertical a 100 rpm por 30 min. A adesão foi observada ao microscópio óptico em aumentos de 40x em GFP e FUC. Para cada tecido foi contado o número de parasitas aderidos em 100 células epiteliais.

Resultados e Conclusão

α-fucosidase é induzida no conteúdo do intestino médio anterior, o citrato inibe a atividade da α- fucosidase e a indução da α-fucosidase é uma resposta às proteínas presentes na alimentação. Alimentamos também com proteínas (hemoglobina e albumina) e açucares (trealose, fucose e fucoidan), não observamos especificidade com relação as diferentes proteínas, entretanto fucoidan resultou em um aumento da atividade. O silenciamento da expressão gênica por RNAi foi bem sucedido e resultou em uma queda na atividade (µU/inseto) nos insetos silenciados em todos os tecidos. O número de parasitos aderidos nas células de insetos silenciados é maior que no grupo controle. Os dados apresentados sugerem que a α-fucosidase intestinal de R. prolixus atua na digestão do sangue e é capaz de modular a infecção por T. cruzi.

Palavras-chave

α-fucosidase, RNAi, Rhodnius prolixus, Trypanosoma cruzi