Dados do Trabalho

Título

Identificação de proteínas expressas em um modelo de infecção in vitro de SARS-CoV-2 por meio de análise proteogenômica

Objetivo (s)

Identificar proteínas codificadas e expressas pela célula hospedeira e pelo vírus em um modelo de infecção celular de SARS-CoV-2.

Material e Métodos

O isolado clínico de SARS-CoV-2/SP02/human/2020/BRA (GenBank MT126808.1) foi propagado em células Vero E6 e o título viral foi determinado por ensaio de placa. Células humanas Calu-3, foram infectadas durante 1h com SARS-CoV-2. Após três tempos pós-infecção diferentes (1, 16 E 36h) o sobrenadante foi coletado para titulação viral por ensaio de placa e RT-PCR. As células foram lisadas e coletadas em H2Omq e inativadas por calor a 80°C por 30 minutos. Foi padronizada e confirmada a metodologia de inativação com diferentes condições e posteriormente, verificado o perfil proteico. A concentração de proteínas foi determinada usando o Kit de Ensaio de Proteína Pierce BCA e os extratos completos foram precipitados com Metanol:Clorofórmio após sonicação. As proteínas foram digeridas em solução seguindo o protocolo para misturas complexas do Laboratório de Espectrometria de Massas LNBio-CNPEM e os espectros cromatográficos obtidos utilizando o sistema NanoAcquity HPLC - LTQ Orbitrap Velos. Integrando esses dados proteômicos com dados genômicos obtidos a partir dos bancos de dados personalizados construídos com dados de repositórios públicos teremos evidencias diretas de tradução dos peptídeos identificados. A análise proteogenômica será realizada seguindo a pipeline desenvolvida previamente pelo nosso grupo permitindo a busca e identificação dos peptídeos. Iremos inferir a função das proteínas identificadas verificando a presença de domínios proteicos conservados e por homologia estrutural.

Resultados e Conclusão

O perfil de corrida em gel dos extratos proteicos das 5 diferentes condições de inativação com calor avaliadas sobre as amostras não teve diferenças com o controle, não entanto, amostras autoclavadas tiveram o perfil alterado. Quando validada a metodologia de inativação foi possível detectar partículas viáveis de SARS-CoV-2 após a condição de inativação durante 60 min 56°C. As outras condições de inativação com calor avaliadas se mostraram eficazes. A cinética da infecção do vírus, determinada por meio de ensaio de placa, mostrou um aumento exponencial com o passo das horas. Os espectros cromatográficos experimentais dos peptídeos obtidos serão comparados com os espectros teóricos obtidos a partir dos bancos de dados personalizados para identificar as proteínas e suas funções no modelo de infecção de SARS-CoV-2.

Palavras-chave

SARS-CoV-2, Proteogenômica, LC-MS/MS.