Dados do Trabalho

Título

Padronização de Reação em Cadeia da Polimerase com curva de dissociação de alta Resolução (PCR-HRM) Para vigilância de linhagens do Genótipo Sudeste Asiático/Americano do vírus Dengue tipo 2 no Brasil.

Introdução

No Brasil, o vírus dengue sorotipo 2 (DENV-2) circulante desde a década de 1990 pertence ao genótipo Sudeste Asiático. No entanto, estudos filogenéticos revelaram a circulação de duas linhagens distintas deste genótipo no país e análises moleculares revelaram alterações nucleotídicas conservadas no domínio II do gene do envelope viral específicas de cada linhagem. Em 2008, a linhagem II do DENV-2 foi responsável pela epidemia mais grave de dengue no Brasil, com aumento significativo na frequência de formas graves, afetando principalmente indivíduos com até 15 anos de idade. Neste cenário, a caracterização das variantes genéticas dos vírus circulantes em surtos e epidemias é de grande relevância para o conhecimento do potencial impacto na população. Rotineiramente, a ferramenta padrão utilizada para estudos de caracterização e vigilância genotípica dos DENV é baseada no sequenciamento genômico. Apesar desta metodologia ser vantajosa ao fornecer dados do genoma viral, as desvantagens incluem o alto custo e a maior demanda de tempo necessário para tal caracterização frente a substituições já descritas.

Objetivo (s)

Desta forma, este estudo objetivou padronizar uma reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real associado à análise da curva de dissociação de alta resolução (High Resolution Melting-HRM) como uma ferramenta de tipagem de linhagens, a partir das diferentes temperaturas de melting entre as linhagens virais.

Material e Métodos

Foram desenhados primers específicos aos polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) E129 e E131, capazes de distinguir tais linhagens. Para o estabelecimento das condições ótimas para o protocolo de PCR-HRM, foram determinadas as temperaturas de melting específicas para linhagem I e II do genótipo Asiático/Americano do DENV-2 e avaliada a especificidade dos primers sintetizados frente a outros arbovírus de importância médica.

Resultados e Conclusão

Os primers sintetizados se mostraram específicos e capazes de diferenciar cada linhagem, em uma reação de duas horas, incluindo amplificação e análise de curva de dissociação. Por se tratar de uma metodologia mais rápida, altamente específica, sensível e com custo mais baixo que o sequenciamento, esta ferramenta visa o fortalecimento dos sistemas de vigilância virológica dos laboratórios de diagnóstico de arbovírus no país, contribuindo para o monitoramento da emergência e reemergência de linhagens do DENV-2 com potencial patogênico para causar epidemias mais graves.

Palavras-chave

DENV-2, PCR-HRM, HRM, LINHAGENS

Agradecimentos

Fiocruz CAPES, CNPq, FAPERJ INOVA-FIOCRUZ