Dados do Trabalho

Título

Avaliação da atividade inibitória do veneno de Bothrops jararacussu contra o alvo molecular Tripanotiona redutase de Leishmania braziliensis.

Introdução

A Leishmaniose é uma doença tropical negligenciada causada por parasitos do gênero Leishmania. Essa patologia está presente em diferentes regiões do mundo. Cepas resistentes e o arsenal terapêutico limitado dificultam a contenção desta doença. Neste contexto, a Tripanotiona redutase se apresenta como um alvo molecular relevante para o desenvolvimento de novas drogas para a terapêutica da leishmaniose. Esta enzima está relacionada com a manutenção da homeostasia redox do parasita.

Objetivo (s)

Avaliar a atividade inibitória de toxinas isoladas do veneno da serpente Bothrops jararacussu sobre a Tripanotiona redutase de Leishmania braziliensis (TRLb) expressa em sistema heterólogo.

Material e Métodos

O veneno de Bothrops jararacussu foi obtido no Banco de Venenos do LabioProt UNIR-FIOCRUZ e fracionado por cromatografia de troca catiônica (CM Sepharose) concatenada à cromatografia de fase reversa em coluna C18, com a eluição monitorada em 280 nm. A dosagem de proteínas foi realizada de acordo com o método de Lowry modificado. A eletroforese em gel de poliacrilamida 12,5% foi feita em condições redutoras e não redutoras. Paralelamente, foi realizada a expressão do alvo molecular TRLb utilizando o vetor pET 28(a+) e E. coli BL21 (DE3). Para a purificação da proteína expressa, foi realizada uma cromatografia de afinidade em resina de níquel Ni-NTA Agarose. A atividade enzimática da TRLb recombinante e o ensaio de inibição da TRLb com a fosfolipase A2 BthTX-I foram realizadas utilizando o substrato T(S)2 acoplado a um sistema de Regeneração da T(SH)2 baseado no DTNB (reagente de Ellman).

Resultados e Conclusão

O método cromatográfico escolhido foi eficaz para o fracionamento do veneno de Bothrops jararacussu e obtenção da BthTX-I em etapa única, o que foi comprovado por RP-HPLC e SDS-PAGE sendo que nesta última foi possível visualizar uma banda única com massa molecular relativa de aproximadamente 15kDa, compatível com o descrito na literatura. Quanto às características da enzima recombinante, a Tripanotiona redutase foi expressa como uma proteína com massa molecular relativa de aproximadamente 54kDa, correspondente a uma unidade monomérica e purificada com as características catalíticas preservadas, comprovadas pelos ensaios enzimáticos capazes de reduzir a Tripanotiona. Por fim, os estudos de inibição mostraram que a BthTX-I foi capaz de inibir a atividade enzimática com um IC50 1,943 mM.

Palavras-chave

Leishmaniose; Tripanotiona redutase; Bothrops jararacussu; BthTX-I.

Agradecimentos

FAPERO, IFRO, Centro Universitário São Lucas, UNIR, Fiocruz - RO.