Dados do Trabalho

Título

Construção de um sistema plasmidial para detecção específica do vírus da Dengue em infecção de linhagens celulares

Introdução

A infecção pelo vírus da dengue (DENV) é um grave problema de saúde pública no Brasil. Em países tropicais e subtropicais, estima-se que cerca de 3 bilhões de pessoas vivem sob risco de serem infectadas pelo DENV. Essa infecção pode causar desde sintomas febris moderados até doença hemorrágica e choque, podendo levar à morte. No Brasil, há apenas uma vacina aprovada contra DENV. Não há antivirais para tratamento dessa infecção. Portanto, ainda se fazem necessárias ferramentas que possam auxiliar no desenvolvimento tecnológico para o combate ao DENV. Alguns trabalhos têm elaborado plasmídeos que ao serem transfectados em células permitem a identificação da infecção pelo DENV. Uma das limitações é a expressão da fluorescência basal relativamente alta que dificulta o uso dessas células na citometria de fluxo. Nosso trabalho evolve o delineamento de estratégias para geração de sistemas onde não haja expressão de fluorescência nas células não infectadas.

Objetivo (s)

O objetivo principal do trabalho é gerar uma construção plasmidial capaz de detectar especificamente o vírus da Dengue quando transfectada em células Vero.

Material e Métodos

A estratégia consiste na construção de um plasmídeo que ao ser transfectado na célula produz fitas de RNA negativa do DENV 2 modificada para conter a sequência da fita negativa do gene da proteína fluorescente verde (EGFP). Durante a infecção, a maquinaria de replicação do vírus poderia transformar essa fita negativa em uma fita positiva que pode ser traduzida gerando fluorescência. Para isso, foi adquirido comercialmente sequências de DNA correspondentes a região 5' e 3' não traduzidas do vírus da dengue e algumas sequências necessárias ao correto processamento do RNA. Utilizando a tecnologia do DNA recombinante, foi incluída a sequência da fita negativa do gene EGFP e o produto final foi clonado no plasmídeo pcDNA3.1-Myc/His. Essa construção foi tranfectada em células Vero utilizando lipofectamina 3000 (Invitrogen) segundo as instruções do fabricante.

Resultados e Conclusão

A primeira transfecção em células Vero, quando examinada ao microscópio indica que não há expressão de EGFP nas células não infectadas. Assim, foi checada a primeira etapa do sistema que corresponde a ausência de fluorescência na ausência de infecção. Na próxima etapa, iremos aperfeiçoar os métodos de inserção do DNA nas células Vero e verificar a expressão de fluorescência durante a infecção pelo DENV.

Palavras-chave

Dengue 2, EGFP, infecção e células Vero.

Agradecimentos

À equipe do LASP e do LAPEM da Fiocruz Bahia e a FAPESB.