Dados do Trabalho

Título

DESENHO E TESTE DE PRIMERS PARA IDENTIFICAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO EM PCR DE LEISHMANIA LINDENBERGI, LEISHMANIA NAIFFI E LEISHMANIA GUYANENSIS

Introdução

A PCR é amplamente utilizada em estudos e diagnósticos de diversas espécies patogênicas diferentes, incluindo na identificação de Leishmania sp. Porém, embora esse método seja mais específico e sensível em relação a outros exames para identificação do gênero, existem empasses quanto à busca pela identificação e diferenciação das espécies desse protozoário, devido sua rica variabilidade, a qual se encontra diretamente relacionada à forma clínica de leishmaniose tegumentar.

Objetivo (s)

Desenhar primers alternativos para identificação e diferenciação das espécies Leishmania (V.) lindenbergi, Leishmania (V.) naiffi e Leishmania (V.) guyanensis.

Material e Métodos

Utilizando as cepas de cultura disponíveis no Laboratório de Leishmanioses “Prof. Dr. Ralph Lainson”, foi realizado PCR convencional com os primers de Hsp70 (1000pb), Hsp70sen (Foward) (5’ GACGGTGCCTGCCTACTTCAA 3’) e Hsp70ant (Reverse) (5’ CCGCCCATGCTCTGGTACATC 3’) em termociclador. Posteriormente os produtos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose, a banda formada foi purificada, quantificada e sequenciada. Após o sequenciamento, as amostras foram alinhadas no BioEdit 5.0 e preparadas para o desenho de primers no Primer3Plus.

Resultados e Conclusão

Foram sequenciadas sete amostras, todas obtiveram boa qualidade/’query cover” (Superior a 95%), foram desenhados 26 primers, dos quais 13 foward e 13 reverse. As sequências do par de primers de melhor qualidade e baixa penalidade foram Foward (5' CACGTTCTTCAGCGAGGAGT 3') e Reverse (5’ GGCTCTTCTTGGTCGGGATC 3’) amplificando 566 pb. Desta forma, o alinhamento demonstrou muitas regiões conservadas nas sequências, os primers desenhados apresentaram potencial de diferenciação apenas utilizando sequenciamento, pois uma vez que os primers desenhados amplificam uma região muito conservada, a banda amplificada em um PCR convencional seria de 566 pb independente da espécie, logo antes de testá-los são necessários mais estudos utilizando a ferramenta do mapa de restrição virtual para a possibilidade da diferenciação por PCR-RFLP.

Palavras-chave

PCR. Leishmania. Desenho de primers.

Agradecimentos

Instituto Evandro Chagas, CNPq