Dados do Trabalho

Título

Desenvolvimento de um teste de PCR em tempo real para a detecção de Mycobacterium avium a partir do cultivo em sistema BD Mycobacteria Growth Indicator Tube de amostras pulmonares procedentes de pacientes com suspeita de tuberculose

Introdução

O Mycobacterium avium é uma das micobactérias não tuberculosas (MNT) mais associadas a doenças pulmonares, que se assemelham clínica e radiologicamente à tuberculose (TB), sobretudo em pacientes vivendo com HIV/aids (PVHA). Destaca-se que o cultivo de amostras pulmonares no sistema BD Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) é um importante método diagnóstico, no entanto, requer a confirmação da espécie de micobactéria após sua positividade.

Objetivo (s)

Desenvolver um teste de PCR Real-Time para detectar o M. avium em cultivo de MGIT de amostras pulmonares, provenientes de pacientes com suspeita de TB.

Material e Métodos

Foram desenhados e sintetizados um par de primers e uma sonda TaqMan tendo como alvo o 16S rRNA do M. avium (Mav-VIC). Para determinar a especificidade do teste Mav-VIC, DNAs genômicos procedentes de 15 isolados de M. avium, M. tuberculosis, M. abscessus, M. intracellulare, M. chelonae e M. marinum foram testados em uma reação contendo 400 nM de primers forward e reverse, 200 nM de sonda, 1x Universal PCR Master Mix e água ultrapura em quantidade suficiente de 25 µL. As reações foram realizadas em placas de 96 poços e à amplificação foi realizada no equipamento StepOneplus Real-Time PCR (95°C por 10 minutos, 95°C por 15 segundos e 40 ciclos de 58°C por 30 segundos). Posteriormente, para avaliar o teste Mav-VIC na detecção do M. avium a partir de amostras de cultivo, DNAs totais de 20 cultivos no MGIT de amostras pulmonares, foram extraídos e submetidos ao teste Mav-VIC. Destas, 14 eram positivas e seis negativas para a identificação molecular do complexo M. tuberculosis. As amostras com resultados negativos para M. tuberculosis foram identificadas como M. avium por sequenciamento dos genes hsp65 e rpoB.

Resultados e Conclusão

O alvo Mav-VIC apresentou 100% de especificidade frente as diferentes espécies micobacterianas. Quando o alvo Mav-VIC foi avaliado frente as 20 amostras pulmonares, resultados positivos foram obtidos apenas nas seis amostras identificadas como M. avium (CT médio: 20,5), mostrando uma acurácia de 1.0. Os primers e sonda desenvolvidos mostraram-se acurados para a identificação de M. avium quando utilizado DNA proveniente de cultivo de amostras clínicas de origem pulmonar. Desta forma, destaca-se que este pode ser um método rápido para a identificação de M. avium associado a infecções pulmonares não causadas por M. tuberculosis, o que pode contribuir introdução de esquema terapêutico eficaz.

Palavras-chave

Mycobacterium; Mycobacterium avium; Diagnóstico; PCR Real-Time

Agradecimentos

FAPERGS; CNPq; e CAPES