Dados do Trabalho

Título

Alvos moleculares para o desenvolvimento de terapias antimaláricas: Expressão e prospecção de inibidores da Fosforilase de Nucleosídeos Purínicos de Plasmodium falciparum

Introdução

Os parasitos do gênero Plasmodium são auxotróficos para purinas e sua produção se dá somente pela via de salvamento e neste contexto, a fosforilase de nucleosídeos purínicos (PNP) é uma enzima chave para a via de salvamento de purinas, catalisando a fosforilação da inosina e formando ribose-1-fosfato e hipoxantina. Em outra vertente, a biodiversidade é considerada uma fonte imprescindível de novas moléculas com potencial aplicação biotecnológica, incluindo inibidores da PNP.

Objetivo (s)

Identificação de peptídeos de veneno de serpentes capazes de inibir a PNP de P. falciparum por ensaios in silico e in vitro.

Material e Métodos

A PNP de P. falciparum recombinante foi expresso em sistema heterólogo utilizando E. coli BL21 (DE3) e o plasmídeo pRSET-A contendo o gene da PNP otimizado. A proteína foi expressa fusionada a uma cauda de polihistidinas (6XHis) e purificada por IMAC. O nível de expressão, a massa molecular relativa e o grau de pureza foram avaliados por SDS-PAGE. A atividade foi avaliada colorimetricamente utilizando Pi e MESG como co-substratos. Para guiar de forma racional a seleção das moléculas com ação inibitória sobre a PNP, um banco de dados com estruturas da enzima e toxinas do veneno da B. jararacussu foi montado e submetidas a teste de ancoragem cego utilizando o programa Clus pro 2.0. Os complexos formados (enzima:toxina) foram selecionados e submetidos ao cálculo do ΔG utilizando o programa Prodigy. As toxinas da peçonha da B. jararacussu, obtidas por etapas cromatográficas foram submetidas a ensaios de inibição enzimática in vitro, conforme citado anteriormente.

Resultados e Conclusão

O processo de expressão mostrou-se eficaz, sendo a enzima obtida na forma solúvel e purificada com elevado grau de pureza, apresentando-se no SDS-PAGE 12,5% como uma banda única de aproximadamente 27 kDa, compatível com o descrito na literatura. Após o processo de purificação, a enzima manteve sua capacidade catalítica, sendo capaz de fosforilar o MESG. As anãlises in silico, mostraram que as toxinas com estrutura de fosfolipase A2 BthA-I, BthTX-I e Bth-TX-II promoveram um impedimento estérico na região do sítio ativo da PNP, assim como apresentaram ΔG favoráveis. Por fim os ensaios de inibição mostraram em diferentes graus, a capacidade inibitória da atividade da PNP recombinante. Tomados em conjunto, os resultados mostraram a relevância da biodiversidade como fonte de inibidores da PNP para o desenvolvimento de protótipos de novas drogas.

Palavras-chave

Fosforilase de Nucleosídeos Purínicos; biodiversidade; toxinas.