Dados do Trabalho

Título

Avaliação de marcadores moleculares expressos nas formas promastigotas metacíclicas de Leishmania (Leishmania) infantum com o uso de modelo experimental in vivo de Lutzomyia longipalpis.

Introdução

As fêmeas de flebotomíneos assumem a posição central no ciclo de transmissão dos agentes etiológicos das leishmanioses, pois é no seu trato digestório que as Leishmania spp. assumem a forma infectiva metacíclica, em uma relação espécie-específica. As abordagens moleculares são eficazes na detecção do DNA parasitário, contudo, a detecção se limita apenas a forma infectiva da Leishmania spp., não podendo confirmar infecção natural.

Objetivo (s)

Neste cenário, o objetivo do presente trabalho é identificar marcadores das formas metacíclicas de L. infantum ao longo da metaciclogênese no trato digestório de Lutzomyia longipalpis, buscando desenvolver uma metodologia auxiliar aos estudos de comprovação de competência vetorial de flebotomíneos.

Material e Métodos

Para isso, está sendo desenvolvida uma RT-qPCR com amostras de L. infantum in vitro e in vivo, onde flebotomíneos de colônia foram infectados e agrupados seguindo diferentes tempos pós-infecção e carga parasitária, a fim de avaliar a expressão gênica de potenciais marcadores das formas metacíclicas do parasito. Foram avaliados alvos a partir de um painel de transcritos diferencialmente expressos durante a metaciclogênese de L. infantum. Seguindo a curva de crescimento in vitro, foram analisados diferentes métodos de separação celular para enriquecimento das formas metacíclicas, extração de RNA, síntese de cDNA e as condições ideais da qPCR.

Resultados e Conclusão

As metodologias Ficoll-540, Trizol/clorofórmio e SuperScript IV VILO apresentaram melhores desempenhos. O ensaio de RT-qPCR demonstrou boa eficiência dos primers testados para o método ΔΔCt, na concentração de 10pmol e anelamento à 56°C. Foram selecionados 16 pares de primers desenhados pelo nosso grupo, além de dois pares já descritos, em conjunto com os genes endógenos de α-tubulina, β-actina e GAPDH, como normalizadores. Nos ensaios in vitro, os genes M12Da, M12De, M14Db e SHERP foram os mais expressos pelas formas metacíclicas, e os alvos M12Db, M14Da, Peroxidoxina, NEC e PRO, apresentaram maior expressão durante a fase inicial, de procíclicas. As infecções nos flebotomíneos foram concluídas e daremos início aos ensaios de expressão gênica in vivo, a partir das amostras individualizadas e mantidas em Trizol a -20°C.

Palavras-chave

Leishmania (L.) infantum, metacíclicas, marcadores moleculares, RT-qPCR, competência vetorial.

Agradecimentos

CAPES, CNPq, Faperj, FIOCRUZ